在光學(xué)領(lǐng)域，像差問題的存在影響著該領(lǐng)域的技術(shù)應(yīng)用。像差會(huì)使光波前發(fā)生形變，降低成像的信噪比和分辨率，甚至產(chǎn)生贗像或無法獲得有意義的圖像，該問題特別對(duì)雙光子成像影響

 　　在光學(xué)領(lǐng)域，像差問題的存在影響著該領(lǐng)域的技術(shù)應(yīng)用。像差會(huì)使光波前發(fā)生形變，降低成像的信噪比和分辨率，甚至產(chǎn)生贗像或無法獲得有意義的圖像，該問題特別對(duì)雙光子成像影響嚴(yán)重。因此解決像差問題，實(shí)現(xiàn)活體，例如小鼠大腦皮層深層區(qū)域的高質(zhì)量成像成為光學(xué)成像發(fā)展中亟待解決的課題。

 　　熒光顯微鏡是以紫外線為光源，用以照射被檢物體，使之發(fā)出熒光，然后在顯微鏡下觀察物體的形狀及其所在位置。熒光顯微鏡用于研究細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的吸收、運(yùn)輸、化學(xué)物質(zhì)的分布及定位等。細(xì)胞中有些物質(zhì)，如葉綠素等，受紫外線照射后可發(fā)熒光；另有一些物質(zhì)本身雖不能發(fā)熒光，但如果用熒光染料或熒光抗體染色后，經(jīng)紫外線照射亦可發(fā)熒光，熒光顯微鏡就是對(duì)這類物質(zhì)進(jìn)行定性和定量研究的工具之一。

 　　像差問題一直困擾著光學(xué)領(lǐng)域的工作者。像差會(huì)使光波前發(fā)生形變，不僅降低成像的信噪比和分辨率，使得很多時(shí)候我們只能“霧里看花更甚者，產(chǎn)生贗像，或無法獲得有意義的圖像。像差問題對(duì)雙光子成像的影響尤為嚴(yán)重，因?yàn)樵谀抢�，熒光信�?hào)對(duì)入射光強(qiáng)度的依賴是平方關(guān)系，一旦入射光波前形變，不僅聚焦強(qiáng)度大幅下降，成像分辨率也急劇惡化。因此，如何解決像差問題，實(shí)現(xiàn)活體，例如小鼠大腦皮層，深層區(qū)域的高質(zhì)量成像成為光學(xué)成像發(fā)展中最具挑戰(zhàn)性的問題之一。

 　　近日，來自美國霍華德。休斯醫(yī)學(xué)研究所的研究者與來自中科院上海光機(jī)所的研究人員合作，成功將一種新的自適應(yīng)光學(xué)的方法和雙光子顯微鏡結(jié)合，研發(fā)成功一種新的自適應(yīng)光學(xué)雙光子熒光顯微鏡。通過校正活體小鼠大腦的像差，在視覺皮層的不同深度處均獲得了提高數(shù)倍的成像分辨率和信號(hào)強(qiáng)度，大大改進(jìn)了成像質(zhì)量，使得原來在活體鼠腦中不可見或者模糊的細(xì)節(jié)變得清晰可見。這一新的自適應(yīng)光學(xué)方法，首次使得在活體小鼠深層區(qū)域成像中獲得近衍射極限的成像分辨率成為現(xiàn)實(shí)。

 　　在該自適應(yīng)光學(xué)雙光子熒光顯微鏡中，研究者將空間光位相調(diào)制器光學(xué)共軛到顯微物鏡的后焦平面，通過位相調(diào)制器將入射光分成若干子區(qū)域，每一塊子區(qū)域的波前都可以被獨(dú)立控制。同時(shí)，利用數(shù)字微陣列光處理器，以不同的頻率同時(shí)調(diào)制其中一半子區(qū)域的入射光強(qiáng)度，以另一半子區(qū)域作為“參考波前”。來自所有子區(qū)域光束會(huì)在焦點(diǎn)處會(huì)聚干涉，通過監(jiān)測焦點(diǎn)激發(fā)的雙光子信號(hào)隨時(shí)間的變化情況，并進(jìn)行傅里葉變換分析，可以“分解”得到被調(diào)制的每一塊子區(qū)域的“光線”的貢獻(xiàn)信息，從而可以實(shí)現(xiàn)對(duì)一半子區(qū)域波前的并行測量。對(duì)另一半子區(qū)域重復(fù)這一測量過程，從而獲得整個(gè)入射波前的信息并進(jìn)行校正。

 　　將高清晰圖像與使用簡便的系統(tǒng)，以及廣泛的寬視野顯微鏡應(yīng)用相結(jié)合。研究者使用該顯微鏡除了可以完成從高速成像到TIRF的日常試驗(yàn)之外，還可以獲得超清的影像。獨(dú)特的全內(nèi)反射熒光功能可在多色實(shí)驗(yàn)過程中，通過改變波長以智能方式彌補(bǔ)穿透深度，對(duì)消散的視野方向進(jìn)行全自動(dòng)校準(zhǔn)和選擇，以確保獲得質(zhì)量最佳的全內(nèi)反射熒光圖像與可靠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。動(dòng)態(tài)掃描儀可精確定位激光束，并決定消散視野的準(zhǔn)確穿透深度。使用一些特殊的熒光軟件如徠卡AF7000熒光軟件可全面控制全內(nèi)反射熒光系統(tǒng)，包括校準(zhǔn)與所有顯微鏡功能，確保減少培訓(xùn)的時(shí)間以盡快投入到科學(xué)研究中。

 　　該方法耗時(shí)很短，通常約1~3分鐘左右即可完成像差的測量和校正，無需復(fù)雜的計(jì)算，適用于任何標(biāo)記密度和標(biāo)記類型的樣品。更重要的是，得到的像差校正圖案可以用于提高較大視場范圍內(nèi)的成像質(zhì)量。該方法無疑為在體研究小鼠大腦皮層深層區(qū)域的生物、醫(yī)學(xué)問題提供了可行性方案。